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生物制藥工藝中收獲方法選擇考量
更新時(shí)間:2024-09-02 瀏覽次數(shù):1512
在生物制藥工藝中,收獲是承上啟下的一步,該步驟收取上游工藝中生產(chǎn)表達(dá)的產(chǎn)物,轉(zhuǎn)移給下游做分離純化,起到去除雜質(zhì)、減輕下游分離純化負(fù)擔(dān)的作用。
上游工藝中表達(dá)的產(chǎn)物,根據(jù)其在培養(yǎng)液中存在的方式可分為三類(lèi)。
第一類(lèi)是分泌到培養(yǎng)基中的產(chǎn)物,如單抗類(lèi)藥物;此類(lèi)產(chǎn)物要收獲的是澄清液,需要除去固體雜質(zhì)及部分溶解在上清液中的雜質(zhì)。
第二類(lèi)目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞本身就是產(chǎn)物,如大腸桿菌表達(dá)的包涵體、益生菌類(lèi)等;需要收獲的目標(biāo)產(chǎn)物是細(xì)胞。產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的,要進(jìn)行細(xì)胞破碎或裂解釋放出產(chǎn)物,然后再除去固體雜質(zhì)。
第三類(lèi)目標(biāo)產(chǎn)物同時(shí)表達(dá)在培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi),如一些病毒載體疫苗。通常要先進(jìn)行細(xì)胞裂解釋放出產(chǎn)物,然后再除去固體雜質(zhì)收獲澄清液。
收獲選擇的方法必須匹配上游培養(yǎng)工藝的特點(diǎn)(哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌、高或低密度等)以及產(chǎn)物的性質(zhì)(蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)胞等),同時(shí)提供適合后續(xù)純化步驟所需的生物工藝料液。所以選擇合適的收獲方法至關(guān)重要。目前收獲主要使用的方法有兩大類(lèi):過(guò)濾和離心。這兩類(lèi)方法各有優(yōu)缺點(diǎn),每類(lèi)方法又可以細(xì)分多種。收獲時(shí)可能只使用其中一類(lèi)方法,也可能兩類(lèi)方法搭配使用。
收獲步驟使用的過(guò)濾技術(shù)主要是以深層過(guò)濾為主。深層過(guò)濾通過(guò)多孔的介質(zhì)截留流動(dòng)相中的顆粒物質(zhì),其截留不僅僅在介質(zhì)的表面,更多的是在介質(zhì)內(nèi)部,因?yàn)樯顚舆^(guò)濾的介質(zhì)都有一定的厚度。除了通過(guò)孔截留,有些深層過(guò)濾器還有一些其他特性,比如有的介質(zhì)帶電荷、有的過(guò)濾器里加了助濾劑(硅藻土、活性炭等),通過(guò)這些改造可以吸附除去部分溶解性雜質(zhì)(HCP、HCD、病毒、內(nèi)毒素等)。所以深層過(guò)濾既可以除去固體雜質(zhì)也可以除去部分可溶雜質(zhì)。
圖1.深層過(guò)濾原理示意圖
在使用深層過(guò)濾器過(guò)濾料液之前,必須先用水沖洗深層過(guò)濾器,去除可能從過(guò)濾器基質(zhì)中析出的任何松散顆粒和不需要的化學(xué)物質(zhì)。沖洗后,一般還需要用緩沖液平衡濾器,把濾器內(nèi)的水替換成緩沖液以保護(hù)目的產(chǎn)物。之后才進(jìn)行料液過(guò)濾。料液過(guò)濾后,還需要用緩沖液沖洗過(guò)濾器,把過(guò)濾器內(nèi)的殘留料液沖洗出來(lái),增加回收率,但收獲后的沖洗通常也會(huì)導(dǎo)致料液體積增加。
因深層過(guò)濾會(huì)將細(xì)胞、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)截留和吸附在濾器內(nèi),所以深層過(guò)濾器需要有一定載量。當(dāng)培養(yǎng)體積大或細(xì)胞密度很高時(shí),所需濾器數(shù)量也會(huì)相應(yīng)增加。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí),可將多列或多排過(guò)濾器裝載到夾持系統(tǒng)上進(jìn)行深層過(guò)濾。通常,2000L的反應(yīng)器流加培養(yǎng),收獲時(shí)要用30-60塊深層過(guò)濾器。
深層過(guò)濾器是一次性產(chǎn)品,用完之后要丟棄。如用于大生產(chǎn),使用深層過(guò)濾器對(duì)生產(chǎn)空間和人員配置都有一定的要求,并且會(huì)產(chǎn)生大量的固體廢物。因?yàn)闉V器的存放需要空間,這么多濾器的管理、領(lǐng)料、轉(zhuǎn)運(yùn)、安裝、拆卸、滅活丟棄,都需要人工操作。尤其是濾器使用完從夾具上拆卸時(shí),濾器通常已被浸濕,單個(gè)濾器的重量能達(dá)到十多公斤,搬運(yùn)起來(lái)不方便,對(duì)力氣相對(duì)較小的女性不太友好。
近年來(lái),細(xì)胞株的高效開(kāi)發(fā)、培養(yǎng)基配方的優(yōu)化、上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝的技術(shù)提升等給收獲帶來(lái)了更高的細(xì)胞密度和更高的產(chǎn)量。這些變化也給收獲帶來(lái)了更多挑戰(zhàn)。近年來(lái)各種預(yù)處理方式開(kāi)始受到關(guān)注,如絮凝劑處理,已經(jīng)有部分藥企采用。絮凝劑的加入使小顆粒形成尺寸較大的顆粒,搭配特定的深層過(guò)濾器,可以大大增加濾器處理量,減少濾器使用量。
通過(guò)離心可以把細(xì)胞、細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)從培養(yǎng)液中分離出來(lái)。離心大致分為非連續(xù)離心和連續(xù)流離心兩種方式。
非連續(xù)離心使用普通離心機(jī),單次處理量小。并且普通離心機(jī)需要每個(gè)離心杯手動(dòng)裝液和配平,離心后還需要逐個(gè)手動(dòng)打開(kāi)倒出上清液,操作繁瑣,用時(shí)較長(zhǎng)。所以普通離心機(jī)更適用于少量培養(yǎng)液的離心。一般100L以下的培養(yǎng)液還可以通過(guò)增加離心機(jī)數(shù)量實(shí)現(xiàn),超過(guò)100L培養(yǎng)液的處理從周轉(zhuǎn)效率、設(shè)備空間和成本上考量,普通離心機(jī)都不再合適。
連續(xù)流離心機(jī)離心時(shí)持續(xù)進(jìn)液,同時(shí)不斷地流出處理好的清液,可以用來(lái)處理大體積高密度的培養(yǎng)液。生物工藝中常用的連續(xù)流離心機(jī)有筒式連續(xù)流離心機(jī)和碟片式連續(xù)流離心機(jī)。
筒式連續(xù)流離心機(jī)由于不能自動(dòng)排渣,使用場(chǎng)景有限;
碟片式連續(xù)流離心機(jī)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)排渣,更為常用。
離心機(jī)利用離心力實(shí)現(xiàn)固體分離,過(guò)高的離心力會(huì)帶來(lái)較大的剪切力,導(dǎo)致細(xì)胞破碎釋放胞內(nèi)雜質(zhì);離心力過(guò)低,則不能有效去除固體物質(zhì)。所以需要進(jìn)行離心工藝的開(kāi)發(fā)。但是,由于碟片式連續(xù)流離心機(jī)的特點(diǎn),缺少有效的小規(guī)模模型進(jìn)行離心工藝開(kāi)發(fā),工藝開(kāi)發(fā)需要在中試或大規(guī)模級(jí)別上進(jìn)行。
離心分離能除去絕大部分固體雜質(zhì),但一些顆粒很小的雜質(zhì)可能無(wú)法去除,所以一般離心處理之后,還需經(jīng)過(guò)一次深層過(guò)濾,除去部分可溶性雜質(zhì)及微小顆粒。離心機(jī)的合理運(yùn)用能在很大程度上減少深層過(guò)濾膜包的使用量。
圖2.碟片式連續(xù)流離心機(jī)運(yùn)行結(jié)構(gòu)示意圖
碟片式連續(xù)流離心機(jī)的傳統(tǒng)機(jī)型是不銹鋼材質(zhì),需要配套的CIP、SIP、氣體等公用工程支持。不銹鋼設(shè)備在前期的投入會(huì)比較大,建設(shè)周期也相對(duì)較長(zhǎng)。當(dāng)前由于一次性技術(shù)在生物制藥工藝中廣泛應(yīng)用,現(xiàn)在已有離心機(jī)廠家推出一次性碟片式連續(xù)流離心機(jī)。一次性碟片式連續(xù)流離心機(jī)在前期的投入相對(duì)較小,幾乎無(wú)需安裝,到貨即可使用;但后續(xù)可能會(huì)有一些耗材成本。
下面對(duì)目前主流的收獲方法進(jìn)行對(duì)比總結(jié):
總體而言,選擇收獲方法時(shí)需要根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品特性、收獲技術(shù)的特點(diǎn)和整體工藝經(jīng)濟(jì)性,綜合考慮選擇合適的收獲解決方案。
Alfa Laval的碟片式連續(xù)流離心機(jī),通過(guò)進(jìn)料方式,大大減小了離心過(guò)程中的剪切力,確保離心過(guò)程中細(xì)胞的完整性,不增加后續(xù)分離純化的負(fù)擔(dān)。Alfa Laval既有傳統(tǒng)的不銹鋼碟片式連續(xù)流離心機(jī),又有一次性碟片式連續(xù)流離心機(jī),可滿足您所有的離心需求。
圖3.阿法拉伐不銹鋼碟片式連續(xù)流離心機(jī)
圖4.阿法拉伐一次性碟片式連續(xù)流離心機(jī)及耗材
Merck有多個(gè)系列深層過(guò)濾產(chǎn)品,包含不同規(guī)模大小的濾器和夾具,可滿足不同的生產(chǎn)工藝。如:Millistak+®DE系列(含硅藻土)適用于普通的初級(jí)或二級(jí)澄清、Clarisolve®深層過(guò)濾器+絮凝劑適用于高細(xì)胞密度料液、Millistak HC Pro®深層過(guò)濾器(全人工合成介質(zhì))具有潔凈、批次間差異小,降低50%沖洗水量等優(yōu)點(diǎn)。
圖5.默克生產(chǎn)級(jí)別3層深層過(guò)濾夾具
圖6.默克Clarisolve®系列深層過(guò)濾器和絮凝劑
圖7.Millistak+® DE系列過(guò)濾器(含硅藻土)
廣州東銳科技有限公司是阿法拉伐碟片式連續(xù)流離心機(jī)和默克深層過(guò)濾產(chǎn)品華南區(qū)授權(quán)代理商。如您對(duì)相關(guān)產(chǎn)品感興趣,歡迎致電交流!