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X-tremeGENE™轉(zhuǎn)染試劑Protocol和答疑貼

更新時(shí)間:2023-01-30 瀏覽次數(shù):1221

今天Emma女士來和大家一起聊一聊轉(zhuǎn)染,什么是轉(zhuǎn)染呢?


PART 01 認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)染


轉(zhuǎn)染——是指將外源基因如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,其應(yīng)用越來越廣泛。



PART 02 常見的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)


細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類:物理介導(dǎo)法、化學(xué)介導(dǎo)法及生物介導(dǎo)法:


物理介導(dǎo)法

一般是電穿孔法,適用于極難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高,但轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率也很高。


化學(xué)介導(dǎo)法

選用轉(zhuǎn)染試劑與核酸結(jié)合,通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一般轉(zhuǎn)染試劑有以下三種:

  • 磷酸鈣:成本低,但轉(zhuǎn)染效率低,重復(fù)性差;

  • 陽(yáng)離子脂質(zhì)體:轉(zhuǎn)染效率較高,但脂質(zhì)體可能改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu),對(duì)細(xì)胞毒性較大;

  • 非脂質(zhì)體試劑:以脂類為主的多組分試劑,轉(zhuǎn)染效率高,對(duì)細(xì)胞毒性低,且可生物降解。


生物介導(dǎo)法

病毒載體,轉(zhuǎn)染效率高,但整合到基因組的風(fēng)險(xiǎn)大,基因長(zhǎng)度也受限,比較適合構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株。

所以,綜合考慮到高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性的結(jié)合,請(qǐng)看下圖:



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X-tremeGENE™360轉(zhuǎn)染試劑在轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性方面都勝出了ThermoFisher的Lipofectamine。


相信X-tremeGENE™系列也是大家熟悉的經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑,今天Emma女士再來給大家好好聊聊它。


X-tremeGENE™Roche公司的注冊(cè)商標(biāo),我司東銳科技今年三月份也榮升為Roche的一級(jí)代理商。


X-tremeGENE™系列是非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,此系列轉(zhuǎn)染試劑可以在含血清培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),不論是用DNA還是RNA轉(zhuǎn)染,也不論是轉(zhuǎn)染普通細(xì)胞系或者難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,都可以很輕松的找到適合的那一款。


圖片



請(qǐng)看更詳細(xì)的細(xì)胞類型對(duì)應(yīng)表:

用GFP編碼的pcDNA3.1質(zhì)粒或者熒光素酶編碼的pCI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了以下細(xì)胞類型對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑:


圖片

?:可以使用;??:推薦使用;???:最佳推薦使用


話不多說,上Protocol干貨!


轉(zhuǎn)染Protocol以轉(zhuǎn)染12孔板中單孔細(xì)胞的量為


01 平衡試劑

X-tremeGENE轉(zhuǎn)染試劑、DNA和稀釋液平衡至15~25°C,輕輕Vortex轉(zhuǎn)染試劑;

02 稀釋DNA

用稀釋液稀釋DNA,稀釋液可以選擇無血清或者減血清培養(yǎng)基,稀釋后的濃度為1ug質(zhì)粒DNA/100ul稀釋液(0.01ug/ul),輕輕混勻;

03 分裝稀釋后的DNA

分別吸取4管100ul(含1ugDNA)稀釋液至四支無菌管中,管上分別標(biāo)記1:1、2:1、 3:1、和4:1。建議使用無菌離心管或者組織培養(yǎng)處理過的圓底96孔培養(yǎng)板;


重要貼士:zui低稀釋液的量是100ul,如果低于100ul會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)染效率;

04  混勻轉(zhuǎn)染試劑和DNA

分別吸取1、2、3、4ul轉(zhuǎn)染試劑至剛加入100ul稀釋液(含1ugDNA)的四支無菌管中,對(duì)應(yīng)的標(biāo)記為1:1,2:1, 3:1, and 4:1,注意轉(zhuǎn)染試劑不要碰觸到塑料管壁,再輕輕混勻;


重要貼士:避免影響轉(zhuǎn)染效率,未經(jīng)稀釋的轉(zhuǎn)染試劑請(qǐng)不要碰觸到塑料管壁,并不要使用硅化處理的吸頭或者吸管。

05 形成轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物

將轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合物在15~25°C環(huán)境中孵育15分鐘,形成轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物。


重要貼士:對(duì)于某些特殊的細(xì)胞系或者低比例的情況可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間,如達(dá)到30分鐘。

06 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)容器,培養(yǎng)基可以不進(jìn)行更換。以一滴滴加入的方式向細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染試劑/DNA的復(fù)合物。


重要貼士:對(duì)于不同的培養(yǎng)容器,加入復(fù)合物的量不同,以12孔板單孔的量為例,每孔中(含1ml細(xì)胞培養(yǎng)基)加入100ul轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物(含1ugDNA);


加入復(fù)合物后輕輕混勻培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶以保證復(fù)合物的均勻分布,如果條件允許,可以使用搖床低速混勻30秒。


一旦在細(xì)胞中加入了復(fù)合物,就無需再像其它轉(zhuǎn)染試劑一樣需要更換新鮮的培養(yǎng)基。

07 檢測(cè)目的蛋白含量

轉(zhuǎn)染細(xì)胞后將細(xì)胞繼續(xù)孵育18-72小時(shí)。孵育的時(shí)間受許多因素的影響,如DNA載體、細(xì)胞類型、細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)基和表達(dá)蛋白的類型。


孵育之后便可以選擇合適的方式進(jìn)行蛋白的檢測(cè),如熒光定量或者免疫印跡等。

雖然我們有無比可靠的轉(zhuǎn)染試劑,但是有時(shí)候?yàn)槭裁催€是會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳的情況呢?


別灰心,這時(shí)候我們需要放大雙眼,來看一下Emma女士列出的要點(diǎn),逐一排除原因,很快就可以做出理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,絕對(duì)會(huì)給您未來發(fā)表的文章增色哦!


PART 03  轉(zhuǎn)染試劑的技術(shù)答疑


Q:為什么轉(zhuǎn)染效率不高?


未優(yōu)化最佳的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例


影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素較多,主要包括細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、傳代次數(shù)、轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例和孵育時(shí)間、質(zhì)粒大小等,其中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例尤為關(guān)鍵。


對(duì)于不同的細(xì)胞類型,轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的最佳比例也不同。由于不同細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜、核膜等結(jié)構(gòu)存在較大差異,同種轉(zhuǎn)染試劑在不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也不盡相同。


因此,對(duì)于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞,為提高轉(zhuǎn)染效率,必須對(duì)轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例做進(jìn)一步優(yōu)化。


對(duì)于X-tremeGENE™系列的轉(zhuǎn)染試劑,我們建議轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例按照1:1、2:1、3:1、4:1(ul:ugDNA)四個(gè)比例進(jìn)行測(cè)試,選出適合的比例,對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型,3:1的比例是最合適的。


 細(xì)胞的數(shù)量不夠

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型來說,建議在細(xì)胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉(zhuǎn)染,過多或者過少都可能降低轉(zhuǎn)染效率。


 未調(diào)整到最佳的孵育時(shí)間

轉(zhuǎn)染后最佳的孵育時(shí)間為18-72小時(shí),對(duì)于大多數(shù)的細(xì)胞類型和質(zhì)粒來說,最佳的孵育時(shí)間是24-48小時(shí)。


 轉(zhuǎn)染效率受培養(yǎng)基某些組分的抑制

培養(yǎng)基中一些組分如聚陰離子會(huì)影響轉(zhuǎn)染,保證培養(yǎng)基中無這樣的組分。


 轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物的量過少

稀釋后DNA的量zui低為100ul,過低的量會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)染效率。



Q:為什么轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率太高?


細(xì)胞密度不適合

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型來說,建議在細(xì)胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉(zhuǎn)染,過多或者過少都可能降低轉(zhuǎn)染效率。


 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)

對(duì)于常規(guī)細(xì)胞來說,無血清培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不夠,會(huì)降低細(xì)胞的存活率,雖然roche的轉(zhuǎn)染試劑可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,但考慮到細(xì)胞需要血清營(yíng)養(yǎng)成分的供給,應(yīng)使用正常培養(yǎng)基或者減血清培養(yǎng)基。


 轉(zhuǎn)染劑/DNA復(fù)合物未和細(xì)胞混合均勻

應(yīng)該將復(fù)合物以一滴滴緩慢加入的方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,然后輕輕地前后和左右晃動(dòng),使復(fù)合物均勻分布。


 使用了內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒載體

質(zhì)粒應(yīng)該保證是高純度無污染的,可以在提完質(zhì)粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,這樣可以起到除菌的效果。


 質(zhì)?;虍a(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒害作用

高表達(dá)的質(zhì)?;虍a(chǎn)物可能會(huì)使得細(xì)胞本身生長(zhǎng)緩慢或者存活率下降。


 使用了過多的轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物

陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑濃度過高時(shí),由于帶有很強(qiáng)的正電荷,對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞大量死亡,所以應(yīng)降低復(fù)合物的濃度或者增加細(xì)胞的濃度。



PART 04   研究方向?qū)?yīng)篇


快到文末了,如果您還沒選擇好您的轉(zhuǎn)染試劑,也可以按照下面的表格來選擇。


圖片

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如果有更多的問題,歡迎聯(lián)系我們。



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